热应激易造成猪睾丸支持细胞功能损伤，诱发生精障碍，是制约养猪业发展的关键环境因素之一。氯离子通道蛋白3(CLIC3)已被证实参与肿瘤抑制及细胞衰老等生物学过程，但其在睾丸支持细胞热应激应答过程中的调控功能与分子机制尚未明确。本研究以猪睾丸支持细胞为对象，构建43℃处理12 h的急性热应激模型，结合转录组测序筛选出核心差异表达基因CLIC3。采用CCK-8法检测热应激和过表达CLIC3对细胞活力的影响；通过活性氧（ROS）染色和流式细胞术分别检测细胞内ROS水平及细胞凋亡率；采用实时荧光定量PCR检测HSP70、BCL-2、BAX和CLIC3的mRNA表达水平；并通过Western blotting检测HSP70、BCL-2和BAX蛋白表达量及BAX/BCL-2比值，以探究过表达CLIC3对热应激诱导的凋亡相关基因和蛋白表达的影响。结果表明：过表达CLIC3可显著提升热应激条件下支持细胞的活力，降低细胞内ROS累积水平；同时，过表达CLIC3可通过下调促凋亡基因BAX表达、上调抗凋亡基因BCL-2及热休克蛋白HSP70表达，逆转热应激诱导的BAX/BCL-2比值升高，从而显著抑制细胞凋亡。本研究提示过表达CLIC3可缓解热应激诱导的猪睾丸支持细胞损伤，为筛选猪抗热应激遗传标记提供了重要依据。