为探究线粒体基因对猪精子冷冻耐受能力的调控作用，本研究以38头里岔黑猪公猪为实验对象，检测猪精子冷冻-解冻后精子活力及运动学参数，选择冷冻-解冻后精子质量最好和最差的各3头，将其分为耐冻（Frozen-resistant,FR）组与不耐冻（Non-frozen-resistant,NFR）组；采用PCR扩增与测序技术获得FR猪与NFR猪精子线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)全序，经序列比对分析获得FR组与NFR组个体间差异的SNPs，主要位于ND5和ND6 2个基因上；利用Western blot检测6个个体精子ND5和ND6蛋白表达水平，并测定解冻后精子与线粒体功能有关的活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）含量、琥珀酸脱氢酶（Succinate Dehydrogenase,SDH）活性和线粒体膜电位。结果表明：FR组解冻后精子总活力、前向运动活力及各项运动学参数均显著高于NFR组；在FR与NFR猪的ND5基因13 751位点和ND6基因15141位点都检测到相同的SNP变异，并引起相应氨基酸改变；NFR组精子ND5、ND6蛋白表达量显著高于FR组；与FR组相比，NFR组ROS含量显著升高，SDH活性显著降低，线粒体膜电位显著下降。综合以上，猪精子mtDNA基因组的ND5和ND6基因位点突变引起了氨基酸改变，并影响ND5和ND6蛋白表达、精子线粒体能量代谢和氧化应激水平，这可能与猪精子耐冻性有关，为进一步揭示猪精子耐冻性分子机制，筛选耐冻性分子标记提供了理论依据。