本研究旨在探究体细胞克隆技术在濒危地方猪种河套大耳猪遗传资源保护中的应用效果，破解活体保种、精液冷冻保种短板与疫病带来的种质灭失风险，为该品种保种及种群扩繁提供技术依据。选取5个家系共20头河套大耳猪，采集耳组织构建成纤维细胞系，制备混合重构胚胎并移植至代孕母猪；利用50K SNP芯片开展亲缘鉴定，结合基因组数据分析群体遗传特征；分段测定克隆猪生长指标，通过自然配种评测繁殖性能。试验共构建6 760枚克隆胚胎，15头代孕母猪妊娠率为73.33%，成功繁育36头克隆猪；克隆猪3～8月龄生长发育指标符合品种固有规律，5组克隆个体自然配种平均总产仔12.8头、产活仔11.8头，后代发育正常，基因溯源可精准匹配对应供体。体细胞克隆技术可完整保存河套大耳猪种质基因，克隆个体生长与繁殖性能无异于原生个体，能够用于该濒危猪种种质保护与资源扩繁。