为提高后备种公牛精液冷冻效果，本研究分析了猪精浆外泌体对荷斯坦后备种公牛精液冷冻保存效果的影响。在精液进行稀释冷冻前，取基础稀释液1/15体积（原猪精清中1倍浓度精浆外泌体）的抗冻精浆外泌体（高抗冻精浆外泌体添加组）、不抗冻猪精浆外泌体（低抗冻精浆外泌体添加组）、DPBS（对照组）加入到基础稀释液中，在精液冷冻时使用。牛精液分组：解冻后0 h检测时，对照组（Con组）精子活力≤50%、活率≤75%的精液视为不抗冻牛精液；活力>50%、活率>75%的精液视为抗冻牛精液。检测添加猪精浆外泌体对不抗冻牛精液和高抗冻牛精液冷冻-解冻后的精子活力、运动参数、顶体完整率、DNA完整率、抗氧化能力及线粒体膜电位等指标。结果显示：在高抗冻牛精液中添加精浆外泌体后精液质量无显著变化；然而在低抗冻牛精液中，添加外泌体提升了冻后精子活力及运动指标（P<0.05或P<0.01），其中添加高抗冻外泌体的精液在解冻2 h后精子活力（PM）仍保持在50.17%，高于对照组（32.09%）(P<0.001)。此外，与低抗冻牛精液对照组相比，添加高抗冻精浆外泌体极显著地提高了精子顶体完整率（88.99%）和DNA完整率（80.93%），并提高了冻融精液抗氧化能力，包括过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和总抗氧化能力（T-AOC）(P<0.01)。同时高抗冻精浆外泌体有效缓解了低抗冻牛精子的脂质氧化与蛋白质氧化变性，维持其正常功能与活性，并提升精子膜电位水平（P<0.05或P<0.01）。本实验条件下，在冷冻稀释液中添加精浆外泌体对低抗冻牛精液冷冻-解冻后的质量具有显著提升作用，为优化冻精技术、有效提高低抗冻后备种公牛冻精质量提供了科学依据。