多位点基因编辑是通往复合性状协同改良的有效路径，它可以通过并联表达多个单顺反子单导向RNA(Single-guide RNA,sgRNA)和串联表达一个多顺反子sgRNA 2种方法实现。前者元件构成复杂，牺牲了编辑效率；后者结构单一，效率优势明显。本研究利用转运RNA(tRNA)精确自剪切的优点，通过表达双顺反子sgRNA，定点编辑了猪肌抑素基因成熟肽编码区，获得了纯合敲除MSTN的猪原代肾成纤维细胞系，成功构建了基于tRNA串联双sgRNA的载体PX459-tRNA-MSTN，相较于单sgRNA介导及双sgRNA分别介导的方式，串联双sgRNA介导的敲除效率显著提高，并成功实现了MSTN基因的敲除，证实了tRNA自剪切机制在大型动物多基因编辑中的有效性和实用性，为地方猪种的经济性状遗传改良提供了简便、高效的技术方案，展现出在畜牧育种中推广应用的潜力。