蒙古羊精液的体外冷冻保存一直存在精子质量下降、受胎率偏低等技术瓶颈，限制了冷冻精液在绵羊改良及繁育中的推广。鉴于此，本研究通过蛋白质组学筛选冷冻导致蒙古羊精子损伤的关键蛋白。选取3只健康蒙古羊对其鲜精精子和冻存后的精子进行蛋白质组测序，挖掘冻存影响精子质量的关键蛋白，经免疫共沉淀确定与关键蛋白互作的蛋白质，构建蛋白质间互作网络。结果显示：蒙古羊鲜精精子与冻存精子比较共鉴定到89种差异蛋白质，其中上调41种、下调48种（P<0.05）。差异蛋白质GO富集主要涉及线粒体基质、超氧化物歧化酶活性、氧化磷酸化；KEGG富集大多集中于乙醛酸、二羧酸代谢和丙酸代谢、柠檬酸循环等能量代谢通路。2-氢硫辛酰胺脱氢酶（DLD）与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚复合物亚单位9(NDUFB9)是影响冻存精子质量的关键蛋白；与DLD互作的蛋白主要为丙酮酸脱氢酶E1β亚单位（PDHB）和异柠檬酸脱氢酶γ亚基（IDH3G），它们共同调节精子线粒体的能量代谢。本实验结果表明，冻存明显改变了蒙古羊精子能量代谢关键蛋白质的表达，进而影响了精子质量。