子宫内膜腔上皮在妊娠早期最早与胚胎接触，最先实现形态和功能上的转变达到容受态，对胚胎着床具有重要意义，但目前湖羊子宫内膜上皮细胞体外培养体系仍未建立。本试验基于文献报道的绵羊子宫内膜上皮细胞培养方法，优化分离方法、消化时间、纯化方法，以期建立湖羊子宫内膜上皮细胞分离纯化新方法。选用性成熟的健康空怀湖羊子宫，采用组织块培养法和酶消化过筛法分离细胞，酶消化过筛法细胞得率高，视野中杂细胞少，生长状态较好。分别消化30 min、1 h及30 min后收集组织块再次消化30 min,CCK8结果显示：30 min+30 min组细胞增殖情况最佳，体外培养24、48 h的增殖效果均显著高于1 h组，体外培养72 h的增殖效果极显著高于1 h组和30 min组。30 min组细胞在体外培养72 h后的增殖效果极显著高于1 h组。采用差时消化、差速离心及消化过筛3种方法纯化细胞，差时消化法纯化效率最高，细胞形态均为铺路石状，免疫荧光结果显示视野中细胞均为Cytokeratin 18阳性，证明本试验分离培养的湖羊子宫内膜上皮细胞，纯度较高、生长状态良好，为后续进一步探究早期胚胎着床机制提供了基础。