本研究旨在分析荷斯坦牛后肠道微生物菌群在不同日反刍时间下的组成和差异。选取62头泌乳天数（106.27±26.13）d、日产奶量（39.55±5.61）kg、体况相近、1胎次的健康荷斯坦泌乳奶牛，连续15 d记录日反刍时间并计算平均值，日反刍时间平均值高于531.3 min/d的19头牛为高日反刍时间组（HR），低于489.7 min/d的19头牛为低日反刍时间牛（LR），并统计了高、低日反刍时间牛产奶量并进行t检验分析，通过16S rRNA基因高通量测序技术，比较高、低日反刍时间的荷斯坦牛后肠道微生物群落的差异。结果显示：高日反刍时间牛产奶量高于低日反刍时间牛（P<0.05）；Alpha多样性分析表明，低日反刍时间牛的微生物多样性最高，高日反刍时间牛最低（P<0.05），Beta多样性分析表明不同日反刍时间牛的微生物群落结构存在显著差异；在优势菌门中，放线菌门在高日反刍时间牛相对丰度最高，软壁菌门在低日反刍时间牛相对丰度最高（P<0.05）；在优势菌属中，瘤胃球菌科 UCG-005属在高日反刍时间牛中最高，类杆菌真核菌群、克里斯滕森氏菌R7菌群和瘤胃球菌科 UCG-010属在低反刍时间牛的相对丰度最高（P<0.05）；LEfSe分析将LDA阈值设为3时，发现36种门到种水平的菌在不同日反刍时间组间存在显著差异，其中放线菌门、双歧杆菌属、毛螺菌属AC2044群、普雷沃氏菌属1和瘤胃球菌科 UCG-005属等对胃肠道健康起着重要作用。由此可见，高日反刍时间对荷斯坦牛肠道健康的维护更好，生产性能较高；不同日反刍时间牛的瘤胃微生物存在显著差异，特定微生物对宿主免疫和胃肠道健康具有关键作用。